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Temas de Investigación

Áreas científicas

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  • Neurobiología
  • Tráfico intracelular
  • Transducción de señales

En nuestro laboratorio estudiamos algunos de los mecanismos centrales que regulan el tráfico intracelular de proteínas en células eucariotas. En particular nuestro trabajo se centra en el análisis de vías de transducción de señales que se originan en la membrana plasmática a través de proteínas G heterotriméricas, en las cuales participan miembros de las familias de las Fosfolipasas C dependientes de Fosfatidil Inositol (PI-PLC) y las Proteínas Quinasa de las familias C y D (PKC y PKD).

Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron que la fisión de vesículas en la cara trans del Aparato de Golgi (Trans Golgi Network o TGN), y que son dirigidas a la membrana plasmática, es regulada desde esta última por subunidades bgde Proteínas G, en particular las combinaciones b1g2 y b3g2 (Díaz Añel y Malhotra 2005). Estas subunidades son capaces de activar a una Fosfolipasa C beta 3 (PLCb3; Díaz Añel 2007), la cual utiliza Fosfatidil Inositol bi-fosfato (PIP2) para la producción de Inositol tri-Fosfato (IP3) y Diacilglicerol (DAG) en membranas biológicas. El DAG cumple dos funciones: es el encargado de activar a una Proteína Quinasa C novel, la eta (PKCh), y además recluta a la Proteína Quinasa D1 (PKD1) al Aparato de Golgi a través de su primer dominio rico en cisteína. De esta manera la PKChes capaz de fosforilar a la PKD1 en su dominio de activación, la cual, una vez activada, queda habilitada para fosforilar aquellos sustratos, aun no descriptos, que participarían en el proceso de fisión vesicular en el TGN.

Cabe destacar que los resultados detallados arriba fueron obtenidos con líneas celulares no polarizadas (HeLa). En células polarizadas, como neuronas de hipocampo embrionario de rata, la fisión en el TGN no se ve afectada en ausencia de una PKD1 activa como ocurre en HeLa, sino que ante la presencia de una quinasa inactiva se producen claros defectos en la selección y distribución (sorting) de proteínas de membrana específicas del dominio somato-dendrítico neuronal, como es el caso del receptor de Transferrina (TfR) y la proteína relacionada al receptor de LDL (LR1). En ausencia de actividad de PKD1, estos marcadores se comportan en cuanto a su ubicación definitiva como proteínas axonales, mientras que los marcadores típicos del axón, como L1, no modifican su localización final. Conjuntamente, se observó que en las mismas condiciones existiría un aumento de la endocitosis en las membranas dendríticas, lo cual explicaría en gran parte la ausencia de este receptor en esa región de las neuronas (Bisbal et al 2008).

En base a estos resultados, actualmente nos encontramos abocados al estudio detallado de los mecanismos que regulan tanto la fisión de vesículas como el sorting de proteínas. En el primer caso, aspiramos a completar la vía regulatoria de la fisión en el TGN de células HeLa, a través de la identificación de aquellos receptores acoplados a Proteína G (GPCR) que serían los encargados de iniciar la vía de transducción de señales que regula la fisión en el TGN desde la superficie celular. En relación a este tema, hemos encontrado que subunidades ade proteínas Gq también activarían la fisión de vesículas en el Aparato de Golgi a través de una vía similar a la de las Gbgque hemos descripto previamente (Coria et al 2012, en preparación). De esta manera, la búsqueda de los GPCR involucrados en estos procesos podría simplificarse aun más, reduciéndose a aquellos que se encuentran directamente acoplados a Gq. Por otro lado, intentaremos identificar a los posibles sustratos de la PKD1 que estarían involucrados en la regulación del mecanismo de fisión que se lleva a cabo en las membranas del TGN (ver figura).

Figura Final Color

Posibles mecanismos de activación de la fisión en el TGN dependiente de GPCR (Cliquear en la foto para mejor resolución). a) Activación de un GqPCR; b) Activación de una proteína Gq; c) Traslocación de Gaq y/o Gbgal TGN; d) Activación de una PLCb; e) Producción de DAG e IP3 a partir de PI(4,5)P2; f) Activación de una PKC novel por DAG; g) Traslocación de PKD1 al TGN; h) Activación de la PKD1 por la PKC novel; i) Fosforilación de sustratos por la PKD1; j) fisión de vesículas en el TGN y transporte de las mismas a la membrana plasmática.

En relación a los estudios de sorting, en la actualidad estamos investigando el rol de la PKD1 en la correcta distribución de receptores de neurotransmisores (mGluR1 y mGluR5) y de neurotrofinas (TrkA y TrkB), en cultivos primarios de neuronas de hipocampo embrionario de rata. Por un lado analizaremos cómo se afecta la polaridad, el desarrollo y la funcionalidad neuronal cuando estos receptores son incorrectamente localizados en ausencia de una PKD1 activa, y por otro lado estudiaremos si la regulación de la PKD1 en este tipo de células sigue una vía de transducción de señales similar a la existente en células no polarizadas, con la participación de PI-PLCs y de PKC noveles.

Subsidios

 Nuestro laboratorio ha sido financiado por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), el Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), y por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Córdoba (MinCyT-Cba).