Temas de Investigación

Mecanismos de degeneración axonal y Sináptica
Neurodegeneración
Vias de Señalización Neuronal
Transporte Axonal
Motores Moleculares
Patologías de Interés
Alzheimer
Parkinson
Huntington
Enfermedades Motoras
Enfermedades Priónicas
Neuropatías de Degeneración Retrógradas y el Transporte Axonal
Las neuronas son células altísimamente especializadas, moldeadas por millones de años de evolución de acuerdo a la función que desempeñan. Esta exquisita especialización les permite recibir, procesar, almacenar y transferir información óptimamente. En términos generales, las neuronas maduras tienen un cuerpo celular con diversas dendritas para recibir y procesar información, y un solo proceso axonal para la salida de la información a ser transmitida. Las neuronas son particularmente vulnerables a problemas de transportes, debido a que al contrario del cuerpo celular y las dendritas, los axones no tienen la maquinaria de síntesis de proteínas. Todas las moléculas y organelas de membranas requeridas en los axones y sus sinapsis deben ser manufacturadas en el cuerpo cellular y enviadas a los compartimientos apropiados a travez de motores moleculares que se desplazan sobre microtúbulos (Kinesina y Dineína), los cuales son responsables del proceso neuronal conocido como transporte axonal rápido (FAT). Cabe mencionar que mutaciones
puntuales que comprometen, pero no eliminan, la función de dichos motores, Kinesina-1 o Dineína citoplasmática, conllevan a neuropatías de degeneración retrógradas diferentes,paraplegia espástica (Reid, Kloos et al. 2002) y la enfermedad de neuronas motoras (Hafezparast, Klocke et al. 2003). Por lo tanto, estas evidencias biológicas señalan el rol central que juega el transporte axonal rápido en la función neuronal, la viabilidad y la neurodegeneración.
Mecanismos Moleculares que Subyacen a la Alteración del Transporte
Axonal Rápido en Neuropatías de Degeneracion Retrógradas
Datos experimentales de nuestro laboratorio, al igual que de otros han mostrado que existen deficiencias del transporte axonal rápido en numerosas enfermedades neurodegenerativas progresivas, incluyendo a las enfermedades de Alzheimer, Parkinson, Kennedy, Huntington, y Creutzfeldt-Jakob o Vaca Loca (Pigino, Morfini et al. 2003, Morfini, Pigino et al. 2006, Serulle, Morfini et al. 2007, Morfini, You et al. 2009, Pigino, Morfini et al. 2009). Las deficiencias en el transporte axonal rápido se manifiesta en estadíos tempranos durante el desarrollo neuronal, precediendo la degeneración axonal y sináptica, así como de la muerte neuronal (Pigino, Morfini et al. 2003, Stokin, Lillo et al. 2005). Mutaciones en motores moleculares son muy poco
frecuentes, generalmente letales a nivel embrionario, y ciertamente no asociadas a ninguna de las enfermedades neurodegenerativas mencionadas anteriormente. Entonces cabe preguntarse, cual es el la base molecular de la alteración del transporte axonal rápido en éstas neuropatías de aparición tardía? Nosotros proponemos que ladeficiencia del transporte axonal rápido surge como consecuencia de una desregulación funcional de los motores causada por un desbalance de actividades fosfotransferasas (quinasas y fosfatasas), que como consecuencia afectan a ciertas propiedades funcionales de los motores moleculares, dando como resultado una alteración del transporte axonal rápido (Morfini, Burns et al. 2009). Si éstas alteraciones en la regulación del transporte axonal rápido llevan a un cambio sustancial del mismo, la consecuencia final es la misma que la observada por alteraciones de los motores moleculares debido a mutaciones puntuales: alteración en el envío de material altamente importante hacia los axones y sus terminales sinápticos, lo cual desencadenaría una disfunción axonal y sináptica, falta de soporte neurotrófico y por última muerte neuronal.
La Proteína alfa-amiloide Oligomérica es un Potente Inhibidor del Transporte Axonal 
Nuestro laboratorio ha mostrado recientemente que el beta amiloide, el péptico proteolítico piginof1derivado de la proteína precursora del amiloide (APP), en su conformación oligomérica (oA?), inhibe el transporte axonal rápido mediante un mecanismo que involucra la activación de la proteína quinasa casein quinasa 2 (CK2) y la fosforilación aberrante de la proteína motora kinesina-1. La base molecular de la inhibición del transporte retrógrado todavía no ha sido determinado. La dramática inhibición del transporte axonal anterógrado inducida por oA? predice una alteración de la neurotrasmisión. De hecho, la inyección de oA? en la sinápsis gigante de calamar indujo una profunda inhibición de la transmisión sináptica (Moreno, Yu et al. 2009). Un análisis por
microscopía electrónica sugirió que dicha inhibición resultó de una clara reducción en la disponibilidad de vesículas sinápticas en la zona activa, y de la falta de secreción de neurotrasmisores, consistente con la idea de que el oA? inhibe el transporte anterógrado de vesículas sinápticas llevando neurotransmisores en su interior, componentes esenciales para la efectiva transmisión sináptica (Moreno, Yu et al. 2009). Más aún, análisis del transporte axonal retrógrado de la proteína BDNF en ratones que poseen la doble mutación sueca en el gen que codifica para la proteína APP, determinó una
dramática reducción en el transporte de la proteína BDNF desde la periferia hacia el cuerpo celular (Poon, Blurton-Jones et al. 2009). Esta reducción de soporte trófico desencadenará eventualmente un evento de muerte celular programada o apoptosis (ver Figura 1).
Figura 1. Patrón de Degeneración Retrógrada. A) En el sistema nervioso intacto,
las neuronas y sus blancos (ovales anaranjados) se correlacionan de una manera
correcta. De esta forma, la actividad sináptica y el soporte neurotrófico (flechas verdes)
están perfectamente coordinados. B) Cuando la actividad en alguna sinápsis es
comprometida (por ejemplo: por una acumulación de oA?, asterisco rosas, induciendo
por ende una reducción del transporte axonal de componentes presinápticos), los
terminales presinápticos se retraen, reduciendo así el retorno de neurotrofinas. Cambios
en la expresión de genes puede ocurrir, pero el cuerpo celular y su núcleo están todavía
intactos en este estadío. C) Cuando el número de sinapsis funcionales cae por debajo
del límite crítico, los terminales presinápticos remanentes son típicamente apagados y
posteriormente retraídos. Como consecuencia, el suministro de neurotrofinas
provenientes del órgano blanco no son suficientes para mantener el segmento distal del
axon o mantener la viabilidad neuronal. D) A medida que el extremo distal del axon se
atrofia, el núcleo neuronal empieza a exhibir las características clásicas de la muerte
celular programada (apoptosis), las cuales incluyen núcleos picnóticos, achicamiento del
cuerpo celular, deformaciones globosas de las membranas celulares y marca de TUNEL,
características exhibidas por las neuronas en los estadíos mas tardíos de la EA. El
tiempo desde los cambios de la actividad sináptica mas tempranos observados en B,
hasta la clara activación de las vías apoptóticas en D puede ser de meses o años. Esta
figura fue modificada de (Brady and Morfini 2010).
Formas Patológicas de Tau Inhiben Selectivamente el Transporte Axonal Anterógrado 
La visión clásica de la función de la proteína Tau es la de proveer estabilidad dinámica a los microtúbulos (Wang, Yu et al. 1996, Conde and Caceres 2009). En años recientes, nuevas funciones han sido atribuídas a la proteína Tau incluyendo funciones de señalización (Morris, Maeda et al. 2011). Resultados obtenidos en colaboración con diversos laboratorios han demostrado que vías de señalización específicas inducidas por formas patológicas de la proteína Tau son capases de activar a la proteína fosfatasa PP1 (Kanaan, Pigino et al. 2012) dentro del compartimiento axonal. PP1 desfosforila el
aminoácido serina 9 de la proteína quinas GSK3 ?, dando como resultado su activación. La proteína GSK3? activa, fosforila a la proteína motora kinesina-1 en sus cadenas livianas, induciendo así la liberación del cargo que esta siendo transportado. De esta manera, el transporte anterógrado es inhibido específicamente sin afectar el transporte retrógrado. Experimentos de transporte vesicular en preparaciones de axoplasmas de calamar utilizando distintas variedades truncadas de Tau, nos permitieron identificar, que en los primeros 18 aminoácidos se encuentra una secuencia que tiene la capacidad de activar a PP1, el cual fue denominada secuencia PAD (Phospatase Activating Domain). La identificación de un dominio activador de PP1 nos permitió deducir que las formas patológicas de Tau inducen una reducción del transporte axonal via la exposición anormal de la secuencia PAD, la cual activa PP1, que a su vez activa la proteína quinasa GSK3?, la cual induce la liberación del motor kinesina-1 de su cargo, via fosforilación de las cadenas livianas de kinesina-1 (Kanaan, Morfini et al. 2011, Kanaan, Morfini et al. 2011, Kanaan, Pigino et al. 2012).
Objetivos Futuros 
Numerosas preguntas biológicas con importantes implicancias terapéuticas derivadas de nuestras evidencias experimentales necesitan ser respondidas, las cuales representan el motor que dirige nuestro esfuerzo investigativo. Cual es el mecanismo molecular por el cual beta amiloide oligomérico (oA?) activa a la proteína quinasa casein quinasa 2 (CK2)? Cual es el mecanismo inhibitorio del transporte axonal tanto retrógrado como anterógrado inducido por CK2? Cual es el mecanismo molecular de la inhibición de la transmisión sináptica inducida por CK2 y oA?? Que componentes axonales de membranas son específicamente inhibidos en su transporte por oA?, Tau, ?-sinucleína, toxina parkinsoniana MPP+, mutaciones de presenilina-1 (PS-1). Cual es la consecuencia funcional de la fosforilación de kinesina-1 y dineína por las proteínas quinasas CK2 y GSK3?? Que rol juega el citoesqueleto axonal en la inhibición del transporte axonal en la enfermedad de Alzheimer, Parkinson y Creutzfeldt-Jakob (enfermedad de la “vaca loca”)?
Abordaje Experimental 
Para estudiar los mecanismos regulatorios del transporte axonal, tomaremos ventaja del uso de axoplasmas extruídos aislados de calamar, Loligo pealei, un sistema experimental ex vivo único, el cual permitió tanto el descubrimiento del motor molecular anterógrado mas importante denominado Kinesina-1, como el entendimiento de numerosos eventos moleculares regulatorios del transporte axonal. Este sistema experimental ofrece la posibilidad única de explorar a tiempo real, propiedades bioquímicas de axones y motilidad vesicular sin interferencia de actividades dendríticas y/o somáticas. Para responder preguntas relacionadas al rol de proteínas patológicas sobre la actividad y transmisión sináptica, utilizaremos sinapsis gigantes de calamar,
trabajando en colaboración con los Drs. Yuyu Song y Rodolfo Llinas en los Laboratorios de Biología Marina en Woods Hole, Massachusetts.
Para estudiar mecanismos subyacentes a la degeneración axonal y disfunción sináptica utilizaremos un abordaje experimental multidiciplinario, que incluye el uso de neuronas primarias corticales y de hipocampo derivadas de ratones trangénicos, modelo de diversas neuropatologías humanas incluyendo Alzheimer, Parkinson y Creutzfeldt-Jakob. Utilizaremos diferentes técnicas de miscroscpía experimental acopladas a cámaras microfluídicas de aislación para experimentos que requieran microscopía de time-lapse. Utilizaremos tejido humano post-mortem, fibroblastos humanos primarios
de pacientes con diferentes neuropatologías, y también desarrollaremos neuronas primarias derivadas de células epiteliales humanas.
Subsidios
El laboratorio obtuvo un subsidio de la Asociación de Alzheimer, (Alzheimer´s Association), EE.UU (2012-2014).